مروری بر فریز سلولی و اهمیت انجام آن
پس از انجام تکنیک پاساژ سلولی احتمال اینکه محقق و پژوهشگر به تمام فلاسک های محتوی سلولی های کشت شده نیاز نداشته باشد بسیار است.قیمت هود لامینار به همین دلیل محقق سلول های کشت شده باقی مانده را به صورت فریز سلولی ذخیره سازی می کند تا در صورت نیاز بتواند با انجام تکنیک دفریز سلولی، سلول های فریز شده و ذخیره شده را استفاده نماید. این تکنیک برای ذخیره سازی بسیاری از سلول ها کاربرد دارد اما یکی از پر استفاده ترین کاربرد های آن در آزمایشگاه های سلولی و مولکولی و ژنتیک برای ذخیره سازی سلول های بنیادی مزانشیمی می باشد.
این مقاله ضمن معرفی تمام تجهیزات و دستگاه های مورد نیاز برای فریز سلولی، تمام مراحل انجام این کار را با ذکر جزییات شرح می دهد.
تجهیزات و مواد مورد نیاز برای تکنیک فریز سلولی
- PBS ( فسفات بافر سالین )
- تریپسین و EDTA
- انکوباتور
- سمپلر
- FBS ( سرم جنین گاوی )
- فالکون
- سانتریفیوژ
- کرایوتیوب
- DMSO
- یخچال و فریزر آزمایشگاهی
- تانک ازت
مراحل فریز سلولی
- در اولین مرحله فریز سلولی باید محیط کشت داخل فلاسک را خارج نمایید. سپس با استفاده از PBS یا فسفات بافر سالین فلاسک را شستشو دهید.
- اکنون باید به منظور جداسازی سلول ها از فلاسک، با استفاده از سمپلر تریپسین و EDTA به فلاسک اضافه کنید. سپس فلاسک را به مدت 3 دقیقه داخل انکوباتور با دمای مناسب قرار دهید تا واکنش صورت گیرد.
- در این مرحله پس از جدا شدن سلول ها از فلاسک، زمان اضافه کردن FBS می باشد . پس از اضافه کردن FBS به فلاسک اکنون محتویات فلاسک را خارج کرده و این سوسپانسیون را به داخل فالکون منتقل کنید. اکنون فالکون آماده است تا داخل دستگاه سانتریفیوژ قرار گیرد. سانتریفیوژ را بر رویrpm 1200 و دمای 20 درجه سانتی گراد تنظیم کنید. فالکون را به مدت 5 دقیقه داخل ساتریفیوژ با این تنظیمات قرار دهید. با سانتریفیوژ کردن فالکون محلول ها در بالای ظرف و سلول ها در پایین ظرف قرار می گیرند و در واقع از یکدیگر جدا می شوند. محلول فوقانی را خارج کرده و به سلول های ته ظرف محیط کشت اضافه کنید.
- در این مرحله فریز سلولی نوبت شمارش سلولی است. تمام سلول های موجود را با استفاده از تکنیک های مخصوص شمارش کرده و حدود 2 میلیون از سلول ها را جدا کنید. شما باید سلول های جدا شده را داخل کرایوتیوب منتقل کنید و به آن FBS و همچنین DMSO اضافه کنید. DMSO برای این منظور استفاده می شود تا سلول ها یخ نزنند.
- کرایوتیوب را به مدت 1 ساعت داخل فریزر با دمای 20- درجه سانتی گراد قرار دهید. سپس دمای فریزر را بر روی 70- درجه سانتی گراد تنظیم کرده و کرایوتیوب را به مدت 1 روز داخل آن قرار دهید.
- در مرحله آخر کرایوتیوب را داخل تانک ازت قرار دهید. این سلول ها به دلیل ویژگی که تانک ازت دارد می توانند مدت ها ذخیره شوند بدون آن که آسیبی ببینند.
شما می توانید در صورت نیاز به این سلول های فریز شده از تکنیک دفریز سلولی استفاده کنید و سلول ها را از حالت انجماد خارج نمایید و استفاده کنید.
نقش بسیار مهم تانک ازت در نگه داری سلول ها
با توجه به این که تانک ازت از دیواره های کاملا عایق و مقاوم ساخته شده است، می تواند نیتروژن مایع را تا مدت زیادی در خود نگه دارد. نیتروژن مایع دمای بسیار پایینی را تامین می کند که برای نگه داری بافت ها و سلول ها کاملا مناسب است. تانک های ازت YDS را می توانید از شرکت رویان ایران تهیه کنی
DMSO چیست و چه نقشی در فریز سلول های کشت شده دارد؟
DMSO (دی متیل سولفوکسید) یک حلالی آلی، قطبی و آپروتیک است که به دلیل خاصیت نفوذ در غشاء و جابجایی آب، معمولاً به عنوان یک محافظ برودتی استفاده می شود. از این ماده به منظور کاهش تشکیل یخ و در نتیجه جلوگیری از مرگ سلولی در طول انجام تکنیک فریز سلولی به محیط کشت سلول اضافه می شود. البته باید توجه کنید برای انجام این آزمایش حتما DMSO با گرید کشت سلولی خریداری کنید. هنگام کار با این حلال حتما از دستکش استفاده کنید. زیرا دی متیل سولفوکساید به راحتی از پوست دست جذب می شود.
|
https://hakimazma.com/%d8%af%d8%b3%d8%aa%da%af%d8%a7%d9%87/%da%a9%d9%88%d8%b1%d9%87/ |
FBS چیست؟
Fetal Bovine Serum ماده ای است که به چسبندگی سلول ها به فلاسک کمک می کند و همچنین در صورت وجود تریپسین در فلاسک آن ها را از بین می برد. این ماده برای رشد سلول هایی که کشت می شوند بسیار مهم است.
مروری بر فریز سلولی و اهمیت انجام آن
پس از انجام تکنیک پاساژ سلولی احتمال اینکه محقق و پژوهشگر به تمام فلاسک های محتوی سلولی های کشت شده نیاز نداشته باشد بسیار است.قیمت هود لامینار به همین دلیل محقق سلول های کشت شده باقی مانده را به صورت فریز سلولی ذخیره سازی می کند تا در صورت نیاز بتواند با انجام تکنیک دفریز سلولی، سلول های فریز شده و ذخیره شده را استفاده نماید. این تکنیک برای ذخیره سازی بسیاری از سلول ها کاربرد دارد اما یکی از پر استفاده ترین کاربرد های آن در آزمایشگاه های سلولی و مولکولی و ژنتیک برای ذخیره سازی سلول های بنیادی مزانشیمی می باشد.
این مقاله ضمن معرفی تمام تجهیزات و دستگاه های مورد نیاز برای فریز سلولی، تمام مراحل انجام این کار را با ذکر جزییات شرح می دهد.
تجهیزات و مواد مورد نیاز برای تکنیک فریز سلولی
- PBS ( فسفات بافر سالین )
- تریپسین و EDTA
- انکوباتور
- سمپلر
- FBS ( سرم جنین گاوی )
- فالکون
- سانتریفیوژ
- کرایوتیوب
- DMSO
- یخچال و فریزر آزمایشگاهی
- تانک ازت
مراحل فریز سلولی
- در اولین مرحله فریز سلولی باید محیط کشت داخل فلاسک را خارج نمایید. سپس با استفاده از PBS یا فسفات بافر سالین فلاسک را شستشو دهید.
- اکنون باید به منظور جداسازی سلول ها از فلاسک، با استفاده از سمپلر تریپسین و EDTA به فلاسک اضافه کنید. سپس فلاسک را به مدت 3 دقیقه داخل انکوباتور با دمای مناسب قرار دهید تا واکنش صورت گیرد.
- در این مرحله پس از جدا شدن سلول ها از فلاسک، زمان اضافه کردن FBS می باشد . پس از اضافه کردن FBS به فلاسک اکنون محتویات فلاسک را خارج کرده و این سوسپانسیون را به داخل فالکون منتقل کنید. اکنون فالکون آماده است تا داخل دستگاه سانتریفیوژ قرار گیرد. سانتریفیوژ را بر رویrpm 1200 و دمای 20 درجه سانتی گراد تنظیم کنید. فالکون را به مدت 5 دقیقه داخل ساتریفیوژ با این تنظیمات قرار دهید. با سانتریفیوژ کردن فالکون محلول ها در بالای ظرف و سلول ها در پایین ظرف قرار می گیرند و در واقع از یکدیگر جدا می شوند. محلول فوقانی را خارج کرده و به سلول های ته ظرف محیط کشت اضافه کنید.
- در این مرحله فریز سلولی نوبت شمارش سلولی است. تمام سلول های موجود را با استفاده از تکنیک های مخصوص شمارش کرده و حدود 2 میلیون از سلول ها را جدا کنید. شما باید سلول های جدا شده را داخل کرایوتیوب منتقل کنید و به آن FBS و همچنین DMSO اضافه کنید. DMSO برای این منظور استفاده می شود تا سلول ها یخ نزنند.
- کرایوتیوب را به مدت 1 ساعت داخل فریزر با دمای 20- درجه سانتی گراد قرار دهید. سپس دمای فریزر را بر روی 70- درجه سانتی گراد تنظیم کرده و کرایوتیوب را به مدت 1 روز داخل آن قرار دهید.
- در مرحله آخر کرایوتیوب را داخل تانک ازت قرار دهید. این سلول ها به دلیل ویژگی که تانک ازت دارد می توانند مدت ها ذخیره شوند بدون آن که آسیبی ببینند.
شما می توانید در صورت نیاز به این سلول های فریز شده از تکنیک دفریز سلولی استفاده کنید و سلول ها را از حالت انجماد خارج نمایید و استفاده کنید.
نقش بسیار مهم تانک ازت در نگه داری سلول ها
با توجه به این که تانک ازت از دیواره های کاملا عایق و مقاوم ساخته شده است، می تواند نیتروژن مایع را تا مدت زیادی در خود نگه دارد. نیتروژن مایع دمای بسیار پایینی را تامین می کند که برای نگه داری بافت ها و سلول ها کاملا مناسب است. تانک های ازت YDS را می توانید از شرکت رویان ایران تهیه کنی
DMSO چیست و چه نقشی در فریز سلول های کشت شده دارد؟
DMSO (دی متیل سولفوکسید) یک حلالی آلی، قطبی و آپروتیک است که به دلیل خاصیت نفوذ در غشاء و جابجایی آب، معمولاً به عنوان یک محافظ برودتی استفاده می شود. از این ماده به منظور کاهش تشکیل یخ و در نتیجه جلوگیری از مرگ سلولی در طول انجام تکنیک فریز سلولی به محیط کشت سلول اضافه می شود. البته باید توجه کنید برای انجام این آزمایش حتما DMSO با گرید کشت سلولی خریداری کنید. هنگام کار با این حلال حتما از دستکش استفاده کنید. زیرا دی متیل سولفوکساید به راحتی از پوست دست جذب می شود.
|
https://hakimazma.com/%d8%af%d8%b3%d8%aa%da%af%d8%a7%d9%87/%da%a9%d9%88%d8%b1%d9%87/ |
FBS چیست؟
Fetal Bovine Serum ماده ای است که به چسبندگی سلول ها به فلاسک کمک می کند و همچنین در صورت وجود تریپسین در فلاسک آن ها را از بین می برد. این ماده برای رشد سلول هایی که کشت می شوند بسیار مهم است.
چگونه دانش بنیان شویم ؟